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TCR-T细胞将在肿瘤治疗中发挥越来越重要的作用，其发展将给肿瘤患者带来更多的希望。
基于肿瘤特异性和免疫遗传学的优势，新抗原可以成为肿瘤免疫治疗的新靶点，包括肿瘤疫苗、ACT和抗体治疗，以及ICB反应的潜在预测因子。靶向新抗原包括每个患者的单个新抗原或在许多患者的癌症中表达的共同新抗原。基于公共新抗原的现成治疗比个性化新抗原治疗消耗更少的资源和时间。由于个性化的新抗原是患者特有的，它们不能用于大量患者。随着高通量测序的最新进展，个性化的新抗原使免疫系统能够在没有预定义公共抗原的情况下针对恶性肿瘤的适当免疫原表位(图4)。
新抗原疫苗具有可行性高、安全性高、生产工艺简单等优点。它们是刺激、增强和多样化抗肿瘤T细胞免疫反应的有效方法。不同形式的基于新抗原的疫苗(如多肽、核酸和DC疫苗)正在不同肿瘤类型的患者的临床试验中进行评估。目前的多肽和核酸疫苗针对的是来自体细胞突变的新抗原，包括SNV、移码插入缺失和基因融合。DC疫苗可以通过合成肽或核酸脉冲来靶向选定的新抗原，也可以通过引入全细胞裂解物来靶向整个TSA。因此，新抗原疫苗正在成为一种新型的肿瘤免疫治疗方法。
CD8+T淋巴细胞具有识别和清除癌细胞的能力，这些淋巴细胞是在50多年前发现的。在体外扩增的自体TIL过继转移而不经基因修改，已被证明在一些人癌症中诱导完全缓解。这些TIL是从患者身上提取的，在特定情况下扩增，并准备增强其抗癌活性。然后，细胞产物被重新注射到同一患者体内。这些患者以前接受了非清髓性淋巴清除化疗和随后的细胞因子治疗，例如使用IL-2，刺激了强烈的抗肿瘤免疫反应。TIL对新抗原具有丰富的特异性，在实现完全和持久的肿瘤消退方面优于未选择的TIL。与肿瘤抗原特异性TCR的低亲和力相比，大多数新抗原特异性TCR表现出显著更高的亲和力，即使对于表达水平相对较低的同源抗原也是如此。因此，TIL已被用于治疗对当前治疗无效的转移性恶性肿瘤患者，包括化疗、放疗和抗PD-1治疗。
与TCR-T细胞相比，CAR-T细胞方法还有其他优势。它们不依赖于HLA表达和新抗原呈递，这是癌细胞通常用来免疫逃逸的机制。CAR分子的工程化表达包括一个细胞内信号和共信号结构域，以及一个细胞外抗原结合域，使CAR-T细胞能够通过抗体与任何细胞表面蛋白结合，然后激活不依赖MHC的CAR-T细胞。即使抗原不是完全特异的，Boolean逻辑门也可以用于CAR-T细胞。这些门通过激活肿瘤特异性新抗原来提高肿瘤识别的特异性，并通过靶向肿瘤表达的抗原来提高肿瘤细胞的清除效率。CD19靶向CAR-T细胞用于治疗B细胞恶性肿瘤患者的早期临床试验显示出显著的效果，而用于治疗实体瘤患者的CAR-T细胞由于抗原有限而效果不佳。肿瘤新抗原激发了创造性的解决方案，并给实体肿瘤患者带来了CAR-T治疗的希望。适合CAR-T的肿瘤特异性表面新抗原的数量有限，可以通过整合识别肿瘤表面新抗原pMHC复合体的单链可变片段(scFv)来克服。针对新的新抗原的CAR-T细胞正在进行血液和实体瘤的临床试验。可以识别EGFRvIII新抗原的CAR已被构建为慢病毒载体的一部分，并加入了缺失配体结合域和胞浆激酶域的截短的EGFR，以用于体内示踪和必要的CAR-T细胞的消融。人EGFRvIII+异源皮下和原位模型显示，EGFRvIII导向的CAR-T细胞可以控制肿瘤的生长。T细胞可以产生针对肿瘤普遍表达的抗原的CARs，在被高度肿瘤特异性的新抗原如EGFRvIII激活后，如EphA2和IL13R2，并经过训练以执行完全的肿瘤破坏。CAR-NK/NKT和CAR-γδT细胞也被开发为治疗方法。
与不能靶向细胞内蛋白的常规抗体不同，TCR-mimic (TCRm)或突变相关新抗原(MANA)特异性抗体可以通过聚焦于pMHC复合体识别细胞内新抗原。TCRm抗体比TCR具有更强的结合亲和力，TCR已被证明是最小化on-target和 off-tumor影响的关键。这些针对新抗原的抗体很容易转化为各种治疗形式，包括全长抗体、抗体-药物结合物(ADC)和双特异性抗体(BsAbs)。噬菌体展示、酵母展示和遗传平台是用于检测人TCRm抗体的一些技术，这些抗体对HLA呈递的新抗原具有极高的特异性。例如，BsAbs可以用来解决细胞表面突变的p53/pMHC复合体密度不足以将T淋巴细胞招募到肿瘤部位的问题。双特异性T细胞结合蛋白(BiTE)是一种BsAb构建体，通过同时结合肿瘤细胞上的新抗原和T细胞上的CD3复合体为T细胞激活提供有效而强大的信号。因此，基于TCRm抗体的策略可以用于靶向来自癌基因和TSG突变的新抗原，这些新抗原很难用传统方法根除。这可能导致更有针对性的抗癌疗法。TCR-mimic抗体对多肽-HLA分子的亲和力明显优于天然TCR。为了防止交叉反应或与给定肽无关的HLA组分的结合，必须适当地筛选TCR-mimic抗体。与设计的TCR类似，交叉反应可以通过对非靶标多肽的阴性选择来防止。至少有一种合成剂的交叉反应性低于同等的天然受体。
由于新抗原谱的异质性和癌细胞不断进化的免疫逃逸机制，单独的免疫治疗对晚期癌症患者并不有效。多种免疫疗法的结合可以同时针对肿瘤免疫循环的不同阶段，包括抗原的释放和提呈、免疫细胞的启动和激活、免疫细胞的转移和侵袭以及肿瘤细胞的识别和杀伤，从而提高抗癌效果。例如，基于新抗原的免疫治疗联合ICBs，新抗原疫苗联合ACT治疗，基于新抗原的免疫治疗联合传统治疗等。另一种策略是将具有不同机制的治疗方法结合起来，以克服肿瘤异质性诱导的耐药性。所有靶向癌细胞必须具有相同的新抗原表达和呈递模式；否则，没有预测的新抗原的抗性克隆可以存活并赋予克隆性生长优势。因此，精准免疫治疗可以与常规治疗相结合，例如放化疗，在不依赖新抗原的情况下杀死癌细胞。这可能导致更显著和更持久的治疗效果。“癌症-免疫循环”指的是必须启动、引导和扩展的一系列事件，以实现有效根除癌细胞的抗癌免疫反应。简而言之，肿瘤形成产生的新抗原被DC释放和捕获。DC将收集的MHC-I和MHC-II分子上的新抗原传递给T细胞，从而启动和激活针对癌症特异性新抗原的效应性T细胞反应。然后，激活的效应T细胞迁移并渗透到肿瘤，在那里它们识别并最终摧毁癌细胞。癌细胞的死亡会产生更多与肿瘤相关的新抗原，在随后的周期中放大和增强免疫反应。因此，癌症免疫治疗旨在重新启动或放大自我维持的癌症免疫循环。针对肿瘤免疫循环中的限速步骤，已开发了各种免疫疗法，包括通过放化疗和溶瘤病毒促进新抗原的释放，通过肿瘤疫苗和ACT增加肿瘤反应T细胞的数量和质量，通过检查点抑制剂增强免疫细胞的侵袭和细胞毒作用。因此，精准免疫治疗可以与常规治疗相结合，如放疗和化疗，在不依赖新抗原的情况下杀死癌细胞，实现更显著和更持久的治疗效果(图5)。
图5 基于新抗原的联合抗肿瘤策略。肿瘤患者的诊断和常规治疗(Step1)。肿瘤细胞的形成启动T细胞的免疫功能，肿瘤细胞死亡和溶解，导致新抗原的释放(Step2)。肿瘤产生的新抗原由DC释放和捕获，DC将收集的MHC-I和MHC-II分子上的新抗原传递给T细胞(Step3)。针对新抗原的免疫治疗主要包括TCR-T细胞、TILs、CAR-T细胞、CAR-NK/NKT细胞、CAR-γδT细胞和双特异性抗体(Step4)。ACT细胞的过继回输和对肿瘤的趋化作用起到了抗肿瘤作用(Step5)。基于新抗原的DC疫苗治疗(Step6)。免疫细胞在淋巴结内被激活(Step7)。效应性细胞通过淋巴归巢发育为效应记忆细胞(Step8)。效应记忆ACT细胞靶向并杀死肿瘤细胞(Step9)。在一系列治疗后，进行临床评估和疗效监测(Step10)。简而言之，肿瘤免疫循环包括通过化疗、放疗和溶瘤病毒促进新抗原的释放，通过肿瘤疫苗和ACTs增加肿瘤反应性T细胞的数量和质量，通过检查点抑制剂增强免疫细胞的渗透和细胞毒效。
基于检查点抑制剂的免疫治疗在包括肾细胞癌、NSCLC和黑色素瘤在内的多种恶性肿瘤中取得了持久的抗肿瘤效果。然而，在缺乏肿瘤特异性效应T细胞的情况下，患者对ICB治疗没有反应。此外，ICB治疗只影响抗癌免疫途径的一个或两个阶段，如抗CTLA4抗体调节免疫细胞的启动和激活，而抗PD-1/PD-L1抗体集中在T效应细胞的最终负调节。ICBs通过靶向新抗原，包括PRKDC、EVI2B和S100A9，增强复发多发性骨髓瘤患者的特异性T细胞反应。对于对抗PD-1治疗无效或复发的实体瘤患者，基于mRNA的新抗原疫苗，如mRNA-4157、mRNA-5671和BNT122，在多个临床试验中与免疫检查点抑制剂一起使用。ICB治疗可以进一步提高CTL的抗肿瘤效果，包括那些针对突变相关新抗原的CTL。此外，持续暴露于TSA会促进CD8+T细胞的耗竭，CD8+T细胞典型地表达高水平的PD-1和CD39。ICBs可以通过克服抑制的微环境来重振耗竭的新抗原特异性T细胞。
新抗原疫苗和ACT的结合也被成功地用于提高肿瘤治疗的临床疗效。接种疫苗可以增加循环中新抗原反应性T细胞的数量，可能是通过促进T淋巴细胞更好的生长来实现的。或者，疫苗可以诱导从头开始的T细胞反应，克服由于肿瘤细胞对新抗原的不充分交叉递呈而导致的T细胞对新表位的识别不足。疫苗也被用来提高CAR-T疗法消除实体瘤的疗效。
大多数化疗药物和放射治疗是基于其直接的细胞毒作用而设计的，而没有考虑到它们对免疫系统的影响。化疗和放疗可以用来增加肿瘤特异性新抗原的释放，绕过新抗原数量不足等问题来刺激T细胞反应。在化疗和靶向治疗过程中，肿瘤细胞经常会发生新的突变，包括逆转突变，从而导致耐药。许多逆转被预测为编码肿瘤特异性新抗原，为用CAR-T细胞疗法、免疫检查点抑制剂或抗癌疫苗对抗耐药性提供了一种潜在的策略。
尽管在血液系统恶性肿瘤和实体瘤中取得了成功，但基于新抗原的免疫疗法仅在少数有文献记载的患者反应中显示出客观疗效。因此，需要相当多的改变来改善临床结果，包括提高新抗原预测的准确性，克服免疫逃避，以及优化生产过程(图6)。
个体化免疫疗法的广泛使用受到发现靶向肿瘤的新抗原的限制。这是由于突变负荷的异质性和不同肿瘤类型之间新抗原呈递的显著差异。因此，应针对特定的癌症患者进行新抗原的鉴定和预测。新抗原的预测也受到遗传异质性的限制，特别是不同癌症类型、不同个体甚至不同肿瘤亚克隆之间的不同体细胞突变。只有10%的非同义肿瘤细胞突变产生具有高MHC亲和力的突变多肽，只有1%的MHC-肽被患者T细胞识别。此外，肿瘤内突变的异质性增加了新抗原预测的复杂性。肿瘤细胞基因组经历了广泛的生成、克隆、改变和突变丢失。同时，由于T淋巴细胞的有限渗透，患者体内存在的新抗原特异性T细胞的多样性可能不能被单个切除的病变完全捕获。这限制了可用于治疗目的的TCR库。理论上，TMB越高，肿瘤中检测到的新抗原特异性T细胞就越多，从而导致更高的免疫治疗应答率。然而，在血液系统恶性肿瘤和一些上皮性癌症中，低TMB也能产生新的抗原反应性淋巴细胞。在低TMB恶性肿瘤中，新抗原密度不足需要更强大的策略来准确识别CD8+T细胞可以检测到的新的免疫原性表位。因此，可能存在对新抗原特异性T细胞无反应的肿瘤克隆。由于具有选择优势，这些克隆细胞的表现可能优于其他克隆细胞，从而限制了临床益处。
肿瘤可以通过许多机制逃避基于新抗原的免疫治疗，包括新抗原丢失、抗原肽递呈的修饰以及免疫抑制的肿瘤免疫微环境(TME)。
肿瘤特异性新抗原的缺失可能是肿瘤免疫逃逸的重要策略。特别是，许多新抗原是肿瘤发生的副产物，在肿瘤细胞存活中并不起关键作用。新抗原耗竭也可能是抗肿瘤免疫的一个棘手的机制，这限制了个性化新抗原特异性免疫治疗的应用。新抗原缺失可能有多种原因，如拷贝数丢失、转录抑制、表观遗传沉默和翻译后机制。仅存在于特定肿瘤细胞亚群中的新抗原也可能由于CD8+T细胞介导的整个亚克隆细胞群被消灭而丢失。许多缺失的突变被患者的T细胞识别，新抗原编码基因不太可能在免疫细胞广泛渗透的肿瘤中产生。这表明表达新抗原的肿瘤亚克隆可能优先被免疫系统移除。此外，由于染色体区域的缺失或肿瘤亚克隆的消除而导致的新抗原丢失可能会导致对ICBs等免疫疗法的获得耐药性。因此，为了弥补免疫治疗中靶向新抗原的丢失，个性化的新抗原特异性免疫治疗应该针对多个新抗原，从而扩大新抗原应答的范围。
肿瘤可能会发生突变，这种突变不仅会改变新抗原的表达，还会改变HLA杂合性和MHC稳定性，以应对肿瘤免疫压力。这些变化阻碍了新抗原的处理和呈递，从而抑制了T细胞识别和肿瘤杀伤。如果关键抗原呈递基因β2m发生突变或缺乏HLA等位基因杂合性，肿瘤可能能够避免被过继转移的T淋巴细胞识别。第二个已证实的表位丢失机制是由于异常转录、翻译或蛋白质稳定事件导致肿瘤细胞MHC表达下调。总之，这些机制可能有助于部分解释为什么某些癌症中较高的新抗原负荷量与较好的预后无关，这是因为新抗原呈递减少。基于这些发现，如果使用剪接抑制剂或自噬抑制剂激活MHC-I递呈，ICBs在癌症治疗中可能更有效。
肿瘤细胞生活在由侵袭和驻留宿主细胞、分泌因子和细胞外基质组成的异质微环境中。浸润性T细胞包括T细胞(TIL和Tregs)、B细胞、成纤维细胞、巨噬细胞(M1和M2)、MDSCs等免疫细胞和分泌因子，包括免疫抑制细胞因子IL-10和TGFβ。这些成分可以相互作用，诱导支持恶性细胞生长、迁移和转移的环境，从而逃避免疫系统和肿瘤特异性CTL。免疫抑制的TME过程也会损害新抗原的识别和T细胞的激活，包括免疫检查点的抑制，各种TME细胞的免疫抑制效应，以及肿瘤细胞内离子或蛋白质的释放。免疫抑制检查点配体分子(如PD-L1和CTLA-4)可以在生物学上限制T细胞的生长和功能，在免疫治疗期间肿瘤细胞中通常会增加。诱导新抗原表达、CAR和表位扩散相结合的补偿策略可用于解决肿瘤细胞的免疫逃逸问题。MHC-I免疫表位可以通过剪接新表位来扩增，这是由于剪接复合体与RNA相互作用的缺陷，辅助剪接因子的错误降解，或者剪接因子PTM异常。TME中的大多数肿瘤基质细胞表达免疫抑制检查点配体PD-L1，该配体可与表达在T细胞上的PD-1相互作用，导致过继转移的TIL、CAR-T和TCR-T细胞的抗肿瘤功能抑制和耗竭。这种影响可以通过用抗PD-1和抗PD-L1抗体阻断检查点来缓解。在活化的T细胞上表达的CTLA-4具有类似的作用，因为CTLA-4以更高的亲和力与抗原提呈细胞上的CD80/86结合，与T细胞共刺激分子CD28竞争抑制抗肿瘤免疫。抗CTLA4抗体不仅阻断CTLA4和CD80/86之间的相互作用，而且还消耗Tregs，从而促进肿瘤特异性CTL的共刺激和扩增，提高临床效益。
在TME分泌的多种免疫抑制因子中，TGF-β在驱动肿瘤信号转导、重塑和代谢中起着核心作用。TGF-β由多种类型的细胞产生，包括肿瘤细胞、基质细胞和Tregs。它刺激自分泌和旁分泌信号促进血管生成，抑制CD8+和Th1细胞的抗肿瘤反应，诱导肿瘤细胞的上皮-间充质转化，从而促进肿瘤的侵袭。因此，阻断TME中TGF-β信号可增强抗肿瘤反应。事实上，抗CTLA4抗体治疗的一个可能机制是耗尽免疫抑制的TGFβ产生的Treg细胞，从而促进肿瘤特异性CTL的共刺激和扩增。为了进一步提高检查点抑制抗体的效力，已经产生双功能抗体配体，包括针对CTLA-4或PD-L1的抗体融合到TGFβ受体II的胞外区(TGFβRIIecd)，其中TGFβRIIecd分离TME中TGF-β的分泌，而检查点抑制抗体消耗Tregs并促进CTL共刺激。这种双重策略可能对单独耐药检查点抑制剂的癌症更有效。作为TGF-β分离的替代方法，肿瘤反应性T细胞可以与显性阴性TGF-β受体II(DNTGf-βrii)一起转导产生抗TGF-β的抗肿瘤T细胞。在晚期和浸润性前列腺癌的小鼠模型中，表达DNTGf-βrii的TCR-T细胞显示肿瘤完全消退和生存期延长。为了利用TME中高浓度的TGF-β，一项研究将TGF-β受体II的胞外区(TGF-β RII)融合到4-1BB的胞内区。这一策略将TGF-β的免疫抑制作用转化为免疫刺激信号。共表达这种转基因受体可产生相加效应，并改善体内的扩增、持久性、肿瘤溶解和选择性抗肿瘤活性。与TGF-β类似，在TME中高表达的Fas配体介导的T细胞死亡信号也可以通过CSR转化为有利于生存的信号。这些信号通过融合Fas胞外区和4-1BB胞内区来增强工程T细胞的增殖和抗肿瘤功能。
免疫疗法，包括疫苗接种、过继TIL和TCR-T细胞以及ICBs，都依赖于新抗原特异性T细胞。直接检测肿瘤细胞呈递的新抗原可能是建立新抗原反应性T细胞的最有效方法，确保它们识别体内的新表位。然而，新鲜肿瘤标本的稀缺和低TIL冷肿瘤的存在将阻碍TIL治疗的实施。首先，获取TILs需要进行侵入性手术来移除可切除的病变，使其仅适用于部分患者。第二，抑制冷肿瘤中的TME可能会降低TIL来源的新抗原特异性T细胞的效率和数量。容易获得的外周血可能是为ACTs产生大量新抗原反应性T细胞的合适来源。然而，需要强调的是，大量的体外扩增既可以增加T细胞的进一步分化，也可以增加T细胞的假阳性新抗原反应。由于TCR文库不足，大多数癌症患者无法接受TIL治疗。目前正在努力开发有效的策略来分离和快速扩增新抗原特异性T细胞。TIL含有大量的新抗原反应性T细胞，使其成为ACT的重要T淋巴细胞来源。目前，成熟的DC或EBV转化的B细胞系通过多肽脉冲或TMG转染APC来向T细胞递呈抗原。表达新抗原的DC也被用来激活来自未暴露于肿瘤宿主免疫抑制环境的健康供者的自体幼稚CD8+T细胞。然而，由编码mRNA或合成肽脉冲的APC触发的TCR可能不能内源性识别抗原呈递的肿瘤细胞。使用诱导多能干细胞(iPSC)技术可以产生具有干细胞样特性的幼稚和非常早期的记忆T细胞。基于一种独特的三维胸腺器官培养系统，来自iPSCs的未成熟T细胞株现在可以进一步分化为新抗原特异性T细胞，该系统在体外完全概括了疾病。另一个好处是iPSCs可以从单个新抗原特异性αβ克隆出来，并重新分化为大量的CTL。在不久的将来，来自单个CTL克隆的iPSCs将被用于产生足够数量的新抗原特异性TCR-T细胞。这些细胞仍处于幼稚状态，并含有内源性TCR，因此显著提高了基于新抗原的免疫疗法的疗效。
在目前对TCR-T细胞的临床研究中，只利用了攻击单个表位的TCR-T细胞。异质性是肿瘤的一个重要特征。这意味着这种独特的T细胞攻击靶点可能减少甚至消失，导致T细胞治疗失败。单个TCR-T细胞的使用也可能是此类临床试验结果不佳的一个重要原因。为了达到更好的肿瘤治疗效果，必须使用针对不同部位的TCR-T细胞的联合治疗来防止免疫逃逸。
以TCR为基础的免疫治疗的原发和继发耐药机制可能表现为靶抗原在肿瘤细胞中的低表达或异质性，或者肿瘤细胞对T细胞介导的细胞毒作用的内在耐药性。TCR-T细胞治疗耐药的主要机制是肿瘤细胞表面MHC-I/II类分子的丢失或减少，使TCR-T细胞无法识别靶表位。
在TCR-T细胞的临床试验中，大多数抗原识别是由HLA-A2介导的。虽然HLA-A2是人群中主要的MHC分子，其阳性率很高(约1/3的中国人表达HLA-A2)。然而，单纯依赖于识别HLA-A2递呈抗原的TCR-T细胞在相当数量的患者中不适用。仅依赖于HLA-A2的TCR也限制了对靶向抗原的搜索。许多适合TCR-T细胞治疗的抗原可能由其他MHC分子提呈。通过扩增获得的单克隆性或寡克隆性新抗原反应性T细胞也将是一种替代途径。因此，必须开发其他的HLA-多肽四聚体，以扩大对抗原性和反应性TCRs的搜索。
在TCR-T细胞可以用于临床治疗之前，安全性是必须解决的问题。在TCR-T细胞的临床试验中也有死亡病例，原因可能是TCR的亲和力增强，导致T细胞识别同源性高的自身抗原，然后攻击正常细胞和组织，最终导致死亡。因此，在TCR转换中必须考虑功能和安全性之间的平衡。TCR-T细胞治疗的安全性应该通过序列比对、细胞实验和动物实验来仔细确定。另一种确保TCR-T细胞安全性的方法是引入自杀基因，携带自杀基因的TCR-T细胞可以正常发挥杀伤功能。然而，注射自杀基因激活药物后，T细胞会发生凋亡，以避免对T细胞的非特异性杀伤。
在临床研究中，TCR-T细胞治疗的安全性和有效性显示出问题。为了解决这些问题，在TCR-T细胞研究领域，寻找安全有效的靶抗原以提高TCR-T细胞的亲和力和效率一直是研究的重点。然而，值得注意的是，近年来，越来越多的研究以新抗原为靶点寻找反应性TCR，并取得了良好的结果。
新抗原是由基因突变产生的异常多肽。这些抗原通常是肿瘤特异性的，使它们成为良好的治疗靶点。近年来，随着测序技术的进步，对肿瘤组织和正常组织进行高通量测序以寻找新的抗原已经成为可能。在新抗原突变位点确定后，通过与肿瘤浸润性T细胞共同孵育，呈递细胞在突变表位的不同位置表达多个抗原肽，即可发现新抗原反应性TCR。此外，共抑制分子如PD-1、4-1BB和ICOS的表达也有助于寻找新的抗原反应性TCR。靶向新抗原是一种有吸引力的治疗策略，但它属于个体化治疗的范畴，而且成本高昂。目前，它不是TCR-T细胞治疗的主流策略。然而，针对新抗原的TCR-T细胞治疗将是未来的发展方向，甚至可能是主要的研究方向。
CD8+T细胞传统上被认为是主要的肿瘤杀伤细胞。因此，CD4+T细胞在肿瘤治疗中的作用还没有引起足够的重视。然而，近年来发现，CD4+T细胞在肿瘤杀伤中也发挥着重要作用。在TCR的鉴定中，一直在寻找MHC-I限制性TCR序列。将这种TCR转移到CD4+T细胞中也可以促进后者的功能。临床试验也直接证明了CD4+T细胞在肿瘤控制中的作用。在接受新抗原反应性CD4+T细胞后，也观察到肿瘤负荷减少。然而，由于缺乏CD4分子的稳定作用，这些CD4+T细胞很难在体内发挥长期作用。通常认为，TCR对抗原的识别是MHC限制性的，即它识别MHC-I或MHC-II分子提呈的抗原。然而，研究表明，一些TCR可以同时识别MHC-I和MHC-II分子呈递的抗原。这意味着这种TCR可能同时被CD8和CD4稳定。将这种TCR用于治疗将提高CD4+TCR-T细胞的治疗效果。
TCR由α链和β链组成。在天然T细胞中，α和β链由两个基因座编码，每个基因座都被转录和翻译，然后组装TCR。然而，在TCR-T细胞中，为了合成具有功能的外源TCR，有必要考虑将α链和β链基因同时导入同一T细胞。在这个过程中，可以考虑同一载体中的两个载体或两个启动子表达α或β链。然而，这可能会导致外源TCR α链和β链表达失衡，增加TCR错配的概率。因此，一个较好的解决方案是利用连接序列使α链和β链处于启动子的控制之下，以确保分子翻译的平衡。内部核糖体进入位点序列(IRES)是一种广泛使用的双顺反子连接序列，能够实现IRES的共表达。然而，IRES介导的翻译效率较低，导致位于IRES后面的基因表达水平较低。如果使用IRES序列连接TCR的α和β链，仍可能发生错配。在TCR表达系统中，来源于小核糖核酸病毒或猪肠道病毒的2A肽序列是一个很好的选择。多肽2A具有自我切割功能，换句线A序列连接时，这两条链被转录，然后在翻译后被分解成单独的多肽片段。TCR链的量(摩尔)可以通过使用2A序列来表达，以减少错配的概率。值得注意的是，尽管在TCR的α和β链上增加了几个额外的氨基酸，但TCR的功能不受2A序列的影响。
当足够数量的TCR识别并与pMHC结合时，T细胞被激活以发挥作用。通过共刺激可以减少T细胞激活所需的TCR数量。然而，T细胞的持续激活仍然取决于细胞表面TCRs的数量和亲和力。TCR的组装和膜表面的定位是一个复杂的过程，翻译后的α和β链被组装成异二聚体，与多个CD3亚型分子(γ，δ，ε和ζ)结合。CD3分子的数量，特别是ζ亚型，在细胞中是恒定的。如果不能与CD3分子形成完整的复合体，过剩的TCR就会被降解。这个问题在TCR-T细胞中尤为严重。使用强启动子和2A序列可以保证外源TCR在宿主细胞中高效表达。然而，能够与CD3结合的TCR数量是有限的，并且存在与内源性TCR结合的竞争。这将导致大量不能形成功能性TCR-CD3复合体的TCR转基因产物的降解。为了解决这个问题，可以将TCR和CD3分子一起表达。动物实验表明，当TCR与CD3亚型分子共表达时，T细胞表面TCR的表达增加了数十倍。这增加了T细胞对靶抗原的亲和力，同时提高了肿瘤清除和记忆反应的效率。此外，适当修饰TCR编码序列，如删除不稳定的mRNA序列和剪接位点，也可以上调TCR转基因的表达，增强TCR-T细胞的抗癌活性。
TCRs的C区在α和β链的正确配对中起着重要作用。如果能够使外源TCR的C区不同于宿主本身的C区，就可以保证外源TCR正确的异源二聚体形成。实验观察表明，小鼠TCR在人T细胞中的表达效率高于人TCR，提示小鼠TCR可以正确组装并与CD3分子结合。小鼠TCR的C区在这一现象中起着重要作用。基于这一方向，开发并研究了含有人V区和小鼠C区的杂交TCR。结果表明，杂合TCR在人T细胞中的功能比全人TCR更强。这些结果表明，小鼠的C区保证了外源杂合TCR自身的优先配对和杂合TCR-CD3复合体的稳定性，同时提高了TCR的膜表面表达效率。虽然引入小鼠C区可诱导免疫排斥反应，但通过对C区少数氨基酸进行修饰，可显著降低杂合TCR的免疫原性。半胱氨酸在TCRα和β链的配对和稳定中起着重要作用，利用点突变技术，α链第48位的苏氨酸和β链第57位的丝氨酸被半胱氨酸取代，在C区形成额外的二硫键。这种改变提高了外源α和β链的配对效率和稳定性，减少了错配的发生，增加了细胞表面外源TCR的表达，增强了抗原特异性反应。研究表明，这一策略可以减少TCR错配引起的自身免疫病理反应。
使用siRNA或CRISPR/Cas9技术可以减少内源性TCR的表达。这不仅可以防止TCR错配，还可以减少TCR和CD3分子之间的竞争。多项研究已经证明了这一策略的可行性。例如，T细胞共表达MAGE-A4特异性TCRs(其密码子优化的C区与野生型C区不同)和针对野生型TCRs C区保守序列的siRNA。结果表明，MAGE-A4-TCR/siRNA载体转导的人T淋巴细胞表面TCR基因表达上调。此外，将TCR基因转移到γδT细胞也可以防止内源性TCR的错配。但γδT细胞不表达CD4和CD8分子，使用γδT细胞表达功能性α/βTCR需要同时转导CD4或CD8分子来增强γδT细胞的抗原特异性免疫反应。
CD3ζ和共刺激或共抑制分子是直接影响T细胞活性的主要信号分子。TCR-T细胞的功能是通过改变CD3ζ和/或共刺激/共抑制分子的表达和功能来影响的。通过将CD3ζ与TCR的α和β链串联表达，可以增加TCR的膜表面表达，增强抗原特异性T细胞的功能。此外，共刺激信号CD28可以被引入到TCR序列中以增强TCR信号转导。这种方法需要完全去除C区并用CD28的跨膜区替换。因此，这种TCR不与内源性TCR配对，具有更强的激活能力。然而，这种方法直接通过柔性序列直接连接Vα和Vβ，破坏了原始的TCR序列，并不是所有的TCR序列都适用，限制了这种修饰策略的应用。近年来，PD-1备受关注，如果能解除PD-1对T细胞的抑制，TCR-T细胞的功能就能得到有效的改善。目前，CRISPR/Cas9可用于敲除PD-1的表达或表达特异性抗体来阻断PD-1。它不仅可以使TCR-T细胞具有肿瘤杀伤特异性，而且可以阻断共抑制信号，避免肿瘤杀伤功能的抑制。
TCR与抗原之间的亲和力决定了T细胞识别和杀伤肿瘤细胞的能力，这是TCR-T细胞研究的主要焦点。(1)从人工不耐受环境中分离高亲和力TCR的方法如下：该方法利用人源化小鼠产生高亲和力T细胞。体内与肿瘤相关抗原p53有高亲和力的CD8+T细胞通常被删除。用人p53多肽免疫表达人HLA-A2转基因小鼠，可诱导高亲和力的CD8+T细胞的扩增。当从这些高亲和力的TCR序列中分离出来时，这些肽可以用来重定向人CD8+或CD4+T细胞。使用同样的方法，已经分离出对其他肿瘤相关抗原具有高亲和力的T细胞克隆，包括MDM2、CEA和gp100。(2)从MHC不匹配的供者中分离高亲和力MHC限制性TCR的方法如下：从HLA-A2阴性供者的天然淋巴库中分离出对HLA-A2递呈抗原具有高亲和力的T细胞克隆。利用这种方法，分离出对肿瘤相关抗原具有高亲和力的人T细胞克隆，这些高亲和力的TCR基因被克隆到用于基因治疗的载体。在小鼠模型中，人T细胞与同种异体HLA-A2抗原特异性TCR基因转导显示清除肿瘤细胞。(3)通过改变TCR序列来提高亲和力是提高TCR-T细胞治疗效果的有效途径。负责与pMHC结合的CDR区域决定了TCR的亲和力，CDR区域的修饰有望改善T细胞功能。研究表明，在TCR 107位氨基酸的取代可以改善CDR3β环结构的稳定性，增加TCR的抗原特异性。在筛选具有高亲和力突变的TCR时，点突变技术可用于构建各种TCRα链和β链库。然后可以用噬菌体、酵母或T细胞展示组装的TCRs，并进行亲和力筛选。MHC-多肽四聚体是亲和力筛选的重要工具，使用四聚体甚至可以从天然的TCR中筛选出高亲和力的TCR。筛选的高亲和力TCR理论上可以增强T细胞的抗原反应性。然而，一些研究表明，转导了高亲和力TCRs的T细胞对抗原没有反应，甚至有阴性反应。另一个令人担忧的问题是，高亲和力的TCR可能会错误识别抗原，导致脱靶效应。
早期对TCR-T细胞的研究主要集中在如何构建抗原特异性CD8+T细胞。目前，也在考虑CD4+T细胞的影响和作用。CD4+T细胞识别MHC-II类抗原肽的分子递送。与主要发挥细胞毒作用的CD8+T细胞不同，CD4+T细胞主要调节适应性免疫系统，增强CD8+T细胞的功能，并诱导T细胞的长期记忆。虽然分离的对肿瘤抗原具有高亲和力的TCR大多受MHC-I分子的限制，但它们在CD8辅助受体存在的情况下表现最好。研究表明，即使在没有CD8辅助受体的情况下，这些TCR也可以在CD4+T细胞中发挥作用。MHC-I分子限制性TCR可产生肿瘤特异性的CD4+T细胞，从而增强特异性CD8+T细胞的杀瘤能力。出现这种现象的原因可能与CD4+T细胞分泌各种免疫因子有关。此外，抗原特异性CD4+T细胞也被用于治疗肿瘤患者。提示应重视CD4+T细胞在TCR-T细胞治疗中的作用。
过继细胞疗法面临的一个共同挑战是输注细胞在体内的存活时间。对TCR-T细胞和CAR-T细胞的研究表明，T细胞输注可导致记忆的形成，这些细胞可以在体内长期存活。然而，这类细胞的数量太少，无法在实体瘤的治疗中发挥作用。目前，维持T细胞存活的常见方法包括注射外源性IL-2和通过放疗或化疗将淋巴细胞从体内清除。其中，IL-2注射剂的毒性比较明显，尤其是在大剂量应用时，不良反应较为明显。IL-2的不良影响限制了它的使用。为了解决这一局限性，研究人员试图在T细胞中表达IL-2，但结果并不好。另一种方法是使用放化疗消除淋巴细胞，减少内源性T细胞的数量，并避免内源性T细胞竞争细胞生长因子。动物实验表明，如果没有预处理，输注的T细胞无法存活或清除肿瘤。淋巴细胞消除预处理已成为输注细胞治疗的标准做法，包括TCR-T细胞。TCR序列也可以转移到分化较低的T细胞或记忆性T细胞中。除了直接治疗T细胞外，TCRs还可以转移到造血干细胞(HSCs)中。转基因HSCs可以通过阳性选择发育成成熟的CD8+T细胞，并产生快速的抗原特异性反应。此外，通过代谢调节药物影响T细胞分化，如二甲双胍，也有可能延长体内TCR-T细胞的存活时间。
新抗原在癌症免疫治疗中发挥着关键作用，包括肿瘤疫苗、ACTs、基于抗体的治疗和ICBs。针对这些癌症特异性新抗原的治疗策略在不破坏正常组织的情况下为支持新抗原在支持临床成功的免疫治疗中的相关性提供了强有力的理论基础。许多举措正在进行，以开发基于新抗原的个性化或现成的抗癌药物。然而，为了解决先进的个性化新抗原免疫疗法的时机和经济问题，需要在实验和理论上进行改进，包括有效的患者招募、优化的测序技术和新抗原预测算法，以及针对常见新抗原的现成疗法。
有效的患者招募是基于新抗原的免疫治疗的关键。首先，早期切除可能会给临床医生更多的时间来仔细设计、生产和测试基于新抗原的治疗方法，以改善临床结果。其次，早期切除使选择可能有资格接受现成疗法的患者变得更容易，包括针对明确定义的致癌突变的疫苗、TCR或TCRm抗体。第三，癌症治疗，包括化疗、放疗和ICBs，可以刺激T细胞过度分化。一旦患者被诊断为癌症，立即分离自体T细胞或TIL，可以从患者身上收集到最高质量和分化程度最低的T细胞。此外，在早期招募的患者中进行基于新抗原的治疗可以有效地输注基于新抗原的高质量细胞产品，并降低晚期转移性癌症克隆引起的合并症的严重程度。
准确鉴定免疫原性新抗原及其同源TCR是个性化肿瘤免疫治疗发展的关键和限速步骤。免疫原性新抗原可以通过基于NGS数据构建虚拟肽的免疫基因组学方法和使用MS分析MHC负载多肽的免疫标记方法来鉴定，基因组和转录测序数据还与HLA相关多肽的MS图谱相结合，以提高新抗原鉴定的敏感性和特异性。然而，基于新抗原的治疗可能是相当负担得起的，因为应用了更经济的高通量测序和强大的深度学习算法。在计算机化的新抗原检测方法中，全面和有效的一站式计算工作流程或分类基准仍然是临床应用所必需的。高效的一站式计算方法还可以使用大型数据队列来确定新抗原作为患者预后或ICB反应预测生物标志物的潜力。最关键的是，这些表位预测方法的准确性也应该通过早期临床研究中彻底的免疫监测来证实，以促进基于新抗原的肿瘤治疗的发展。除了这些基于高通量测序数据预测免疫原性新抗原和同源TCR的计算方法外，最近还开发了几种T细胞抗原发现策略来无偏地鉴定免疫原性新抗原。多种pMHC文库已经建立，包括酵母展示文库、SABRs、BATLLES等，可以灵活和可扩展地筛选抗原表位。通过依赖T细胞杀伤的生理活性而不是评估TCR-pMHC的结合亲和力，T-Scan能够查询更大的抗原空间，而不依赖预测算法。因此，T细胞配体发现技术的简单性和可扩展性将有助于研究候选新抗原的免疫原性，并有助于新的基于新抗原的免疫疗法的发展。
针对常见新抗原的现成精确免疫疗法是另一种可能的策略，以克服基于个性化新抗原的个体化治疗中的时间和资金问题。患者之间共有的常见新抗原将由驱动基因或TSG产生，热突变肽由相对常见的HLA等位基因呈递。常见的新抗原更有可能在转移性肿瘤中被克隆保守，并在患者体内系统地重新出现。许多通用的治疗技术很容易针对常见的肿瘤抗原，包括疫苗、BSABs、CTLs和TCR-T细胞的过继转移。随后，为晚期癌症患者开发了以HLA特异性方式针对共享新抗原的TCR库。随着更多常见的新抗原和相应的TCR被发现，更多频繁遗传变化导致癌症的患者将从公共新抗原反应TCR库中受益。此外，癌症基因组测序和新抗原预测方法的广泛使用将有助于将患者与针对其肿瘤中常见新抗原的治疗相匹配。因此，这种基于常见新抗原的现成策略有望缩短新抗原鉴定和T细胞培养所需的时间，从而在相当大比例的患者中增加基于新抗原的治疗的使用。
除了癌变过程中自发突变产生的新抗原外，一些共价分子还可以通过修饰高度重复的体细胞突变肿瘤中的热点残基来诱导肿瘤特异性公共新抗原的产生。共价KRAS-G12C抑制剂，如ARS1620，不可逆转地修饰突变的半胱氨酸。携带共价连接小分子的半抗原肽可以通过MHC-I呈递在细胞表面。半抗原肽-MHC复合体可以作为肿瘤特异性新抗原来触发CTL反应。基于这一原理，突变的肿瘤抑制蛋白可以被一类新的分子靶向。这些分子通过共价修饰热点残基（如TP53 Y220C和TP53 R273C）诱导新抗原的产生并触发特异性免疫反应。因此，通过特异性地修饰突变的肿瘤蛋白的半抗原而不是作为药物抑制剂，可以显著扩大适合于治疗靶向的肿瘤特异性新抗原的范围。
这些新抗原为肿瘤疫苗提供了强大的靶点，不仅可以准确地消除残留的肿瘤病变，而且由于其全身特性，还可以有效地靶向远处转移细胞。根据个体肿瘤，通过以下步骤生产个性化新抗原疫苗：采集肿瘤组织和正常样本、独特突变的测序和分析、免疫原性新抗原的预测和验证、疫苗的设计和生产。包括多肽、核酸和DC在内的各种平台可以用于开发基于预测的个性化或匹配的共享新抗原的疫苗。基于多肽、RNA和DNA的新抗原疫苗是可行、安全、经济的疫苗。然而，大多数患者不能通过基于多肽的新抗原疫苗可靠地产生实质性的新抗原特异性CD8+T细胞反应。肿瘤疫苗的所有活性成分，如新抗原、制剂和递送系统都在不断改进。人工合成的含有编码RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)的复制酶基因的自扩增mRNA(samRNA)因其比传统mRNA具有更高和更持久的抗原性而引起了人们的广泛关注。疫苗新抗原的体内表达也可以通过天然携带遗传指令的载体来增强，包括腺病毒(Ads)、逆转录病毒和腺相关病毒(AAV)。此外，还形成各种纳米颗粒，如脂质纳米颗粒、外泌体、病毒样颗粒、笼状蛋白纳米颗粒、细菌膜材料纳米载体、高密度脂蛋白模拟纳米盘、聚合物和聚合物纳米颗粒，以增强个性化疫苗的运输和组织穿透能力，提高免疫原性。与病毒载体相比，纳米颗粒还可以有效地将疫苗和免疫佐剂一起输送到淋巴器官，以增加新抗原的呈递。
从体外负载肿瘤新抗原的血液中分离出单核细胞或造血祖细胞，可有效提高新抗原疫苗的抗癌效果。自体DC可以以肽、RNA和DNA的形式负载新抗原。与耗时和昂贵的患者特异性新抗原的测序和计算分析相比，全肿瘤裂解物(WTL)自体DC疫苗在体外诱导T细胞介导的抗肿瘤反应，是一种更方便、更经济的诱导新抗原特异性免疫反应的方法。整个肿瘤细胞同时含有MANA和未突变的TAA，这可能克服潜在的免疫逃逸和耐药机制。然而，高丰度的非免疫原性自身抗原可能会限制新抗原诱导免疫反应的能力。WTL中也存在各种免疫抑制因子，它们抑制DC成熟和T细胞激活。为了克服这些问题，由肿瘤细胞产生的细胞外小泡(EVs)最近被证明是支持DC成熟和新抗原呈递的疫苗接种平台。肿瘤细胞来源的EVs可以将肿瘤抗原库递送到DC，并促进新抗原的交叉递呈。EVs还含有高水平的免疫刺激物，可以触发DC释放天然免疫信号。除了肿瘤细胞来源的EVs外，DC来源的EVs还可以作为免疫细胞的新抗原提呈单位。基于EV的疫苗可以通过调节TME和全身免疫反应将“冷”肿瘤转变为“热”肿瘤。因此，EVs可能提供一种可以口服的新的基于新抗原肿瘤疫苗的替代形式。
尽管基于新抗原的免疫治疗在早期的临床前和临床研究中显示了良好的结果，但仍有重大进展，特别是在上皮性恶性肿瘤患者中。癌细胞已经进化出内置的防御系统，在癌症免疫周期的每一个阶段都能逃避免疫识别。鉴于癌症免疫逃逸的复杂机制，同时针对癌症免疫循环不同阶段的联合治疗可能更有效。化疗、放疗、靶向治疗、光动力治疗和溶瘤病毒治疗后的细胞死亡将促进新抗原的产生和释放，从而进一步增强抗肿瘤免疫周期。IFN-α、GM-CSF、抗CD40、TLR激动剂和STING激动剂的使用促进了新抗原的呈递。为了促进免疫细胞向肿瘤的渗透，可以使用TME修饰和细胞内细胞因子。ICBs和IDO抑制剂还将改变免疫抑制TME，以加强基于新抗原的免疫治疗。纳米和EV药物递送系统最近被用作同时给药许多药物或治疗药物的集成平台，这些药物或治疗药物协同作用激活癌症免疫循环的不同阶段，逆转免疫抑制并产生免疫支持TME。这些组合策略使用不同作用机制的治疗药物在癌症患者中诱导强大、有效、持久和肿瘤特异性的免疫反应。
TCR-T细胞在治疗肿瘤方面的能力已经被证明。目前，尽管TCR-T细胞疗法还存在一些问题，但这种疗法的强大临床应用前景值得引起更多的关注。随着肿瘤免疫学和基因工程的发展，TCR-T细胞治疗将更加个体化。目前，TCR-T细胞主要集中在“通用靶点”进行治疗。当用于治疗时，TCR-T细胞只考虑抗原和MHC分子的表达。当这两个条件满足时，其就用于治疗多个患者。然而，这些患者的实际情况差异很大，TCR-T细胞治疗的选择性低可能与治疗反应差或无效有关。研究表明，以细胞内抗原为靶点的TCR-T肿瘤免疫治疗已成为近年来的研究热点。如果能根据患者肿瘤相关抗原甚至新抗原的表达来设计单个TCR-T细胞，就有可能显著提高治疗的有效性和安全性。测序技术的成熟和细胞培养技术的进步为这一场景奠定了基础。另一方面，使用分化不足的T细胞或造血干细胞产生体内存活时间更长的TCR-T细胞也将提高此类治疗的有效性。此外，TCR-T细胞可与免疫检查点抑制剂联合使用，以提高TCR-T细胞治疗的疗效。综上所述，TCR-T细胞将在肿瘤治疗中发挥越来越重要的作用，其发展将给肿瘤患者带来更多的希望。
