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　　ELISA方法用于杂交瘤和噬菌体展示筛选是最为广泛的高通量的抗体发现的筛选方法，其实质是亲和力测定方法的一种变种，其目的是需要建立ELISA信号值和样品亲和力大小之间的正相关性。相对于采用ELISA进行抗体的亲和力测定方法，用于杂交瘤和噬菌体展示筛选的ELISA方法有以下难点：1.待测样本极具多样性，且单一样品通常也是混合物，有很大的可能存在非特异吸附；2.不同的待测样品之间可能存在较大的浓度差异，浓度的大小和亲和力的大小均会对检测结果产生影响。在进行杂交瘤和噬菌体展示筛选方法开发时，需要选择合适的条件使信号值主要能够表征亲和力的大小而一定程度上忽略浓度差异造成的影响。本文是ELISA定量测定方法开发和亲和力测定方法开发的进阶版本，配体受体反应的基本原理解析，和两种应用的差异性区分是进行ELISA筛选方法的开发

　　（proportion bound），是一个与抗原的加入量和亲和力大小这两个参数相关的特征函数。具体在ELISA测定过程中当抗体的加入量是恒定值时，proportion bound可以用检测的信号值来等价表示，在ELISA反应中抗原的加入量和Kd将决定信号的大小。

　　在抗原浓度为10nM的条件下，90%的Ab1(Kd=1nM)和50%的Ab2(Kd=10nM)能够形成抗体抗原偶联物，作为ELISA检测的信号值，Ab1，Ab2亲和力10倍的差异反应到ELISA信号值上1.8倍的信号差异；在抗原浓度为1nM的条件下，50%的Ab1(Kd=1nM)和9.1%的Ab2(Kd=10nM)能够形成抗体抗原偶联物，作为ELISA检测的信号值，Ab1，Ab2亲和力10倍的差异反应到ELISA信号值上5.5倍的信号差异；在加入的抗体浓度是相同的情况下，加入反应的抗原的浓度越少，ELISA信号比值的差异和抗体亲和力比值的差异更具相关性。

　　在抗原浓度较高的情况下ELISA信号差异很多情况下由于抗体样品的浓度差异导致的，ELISA信号值对于亲和力大小不具有选择性；只有在抗原浓度较低时，信号值主要能够表征抗体亲和力的大小而一定程度上忽略浓度差异造成的影响，而在ELISA方法开发时当抗原浓度较低时，相对于抗原浓度较高时，其ELISA信号值要弱很多，提升ELISA方法信号的灵敏度，如何通过优化酶联抗体的浓度，挑选显色液和选择显色时间以增强ELISA检测的信号值是一个有区分度的ELISA筛选方法的关键。

　　1.酶标板的制备取浓度为100 ug/ml抗原，室温溶解，混匀用包被液按如下步骤稀释至0.2ug/ml，0.5ug/ml，1ug/ml，按加样布局表加入100ml/孔，分别加入酶标板条中(Note 2)，其中加入包被液做包被抗体的空白对照，2-8℃过夜。

　　2.用洗涤液洗板3次，拍干，加入300ml/孔封闭液(Note 3)室温封闭1小时；洗涤液洗板3次，拍干待用；

　　3.取出包含有阴性对照和阳性对照过夜孵育制备含有噬菌体的深孔96孔板，在奥豪斯高速离心机中2000g离心15min，取上清，稀释10倍，一一对应加入包被好酶标板中。(Note 4)

　　9.取酶联抗体对应的TMB显色液，临用前20分钟拿出平衡到室温，在漩涡混合器上混匀；（Note 6）

　　Note1：由于不同的噬菌体样品有不同的亲疏水性，其对酶标板材的非特异吸附强度不一样，做一块没有抗原包被的阴性对照板是十分有必要的。

　　Note2：在包被过程中，建议选择疏水性酶标板材（polysorp）,这样可以极大的减少背景信号值，提高整个方法的信噪比。

　　Note3：在有生物素化抗原参与的ELISA实验中，不要加入含脱脂奶粉的封闭剂，脱脂奶粉含有微量生物素，会干扰整个检测体系。

　　Note4：噬菌体上清液的稀释比例，可提前根据阳性噬菌体样品做好稀释预实验进行确定。

　　Note5：应选择抗噬菌体的P8蛋白的酶联抗体，噬菌体有2000个以上的P8蛋白，适当的增加酶联抗体的浓度可以提高方法的灵敏程度，笔者曾增加5倍的酶联浓度得到了3倍的信号提升。

　　Note 6：市面上TMB底物最低和最高有10倍的显色差异，建议选择市面上最强的TMB显色底物。

　　Note 7：显色时间可适当的延长，一般来说在30分中内显色的信号值和显色的时间成线性。

　　Note 8：条件的选择最终是通过阳性噬菌体的信号值决定的，阳性噬菌体的亲和力大小是一个非常重要的选择参数。

　　如阳性噬菌体的亲和力为1nM时，筛选的目的是得到高亲和力的抗体，可以选择阳性噬菌体的信号在OD值为0.5时的条件作为最终的筛选条件，这样很多OD值很小的低亲和力的抗体均被过滤掉；筛选的目的是尽可能得到多的亲和力抗体，可以选择阳性噬菌体的信号在OD值为2-3时的条件作为最终的筛选条件，低亲和力的抗体在OD值上也不会太小，可以得到体现。

　　一个稳健的能用于杂交瘤和噬菌体展示筛选方法是ELISA各种耗材，试剂和实验条件的完美组合，需要对试剂耗材的多种可能进行探索，也是平台经验的系统汇总，以下是用于筛选方法的优化方向的汇总。

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